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乳がんの新しい治療薬に向けて(

女性ホルモン受容体 α 型へ特異的にはたらく阻害剤を発見

著者

ビスフェール A (BPA) はプラスチックの原料として広く利用されています。ところが近年、BPA がヒト核内受容体へと結びつき、内分泌かく乱物質として毒性をもつことが指摘されました。そこで様々な BPA 類似物質が代替として用いられていますが、それらの反応を実際に調べた実験はまだ数えるほどしかなく、BPA 類似物質が生体におよぼす影響はよく分かっていません。そこで構造機能生化学研究室の枡屋宇洋さんと松島准教授らは、127 種類もの BPA 類似物質について女性ホルモン受容体 α 型との結合を系統的に調べ上げました。5 種類の化合物が、女性ホルモン作用の阻害剤であることを新発見しました。4 つの阻害剤には三環系ビスフェノールという共通構造がありました。この構造が阻害剤として好まれる理由を分子ドッキング法から裏付けました。より根本的な理解へ向けて、DV-Xα 法という第一原理計算をタンパク質系へと世界で初めて適用しました。以上のような基礎研究は、乳がんのような女性ホルモン依存がんの治療薬につながると期待されます。研究成果は Scientific Reports に掲載されました。

枡屋宇洋(研究当時:理学府化学専攻)、松島 綾美(理学研究院 化学部門)
取材:石井 優大 (理学研究院)

ビスフェノール類は毒にも薬にもなる!?

ビスフェノール A の低用量作用による有害性

ビスフェノール A (bisphenol A: BPA) とよばれる化学物質は、ポリカーボネート樹脂やエポキシ樹脂などのプラスチックの原材料として広く使われています (図1)。

図1
図1ビスフェノール A の工業的な利用 ほ乳瓶、缶詰の内面塗料、水道管といった色々な工業製品の原材料として利用されている。図の一部をいらすとやより引用。

ところが 1990 年代に BPA の低用量作用low-dose effectによる有害性が指摘されました。マウスによる実験では、BPA の摂取がごく低濃度であっても前立腺肥大などの成長上のリスクが現れたり、キレやすい情動を示したりするという報告がなされています。とくに胎仔や幼体においては、脳・神経系にも悪影響を及ぼすことが懸念されています。一方で、少量であれば人体には影響がないとすると報告もあり、BPA が有毒かどうかの真偽については世界各国でいまだに白熱した議論がおこなわれています[1]

BPA は内分泌かく乱物質としてはたらく

BPA はどのようにして身体へ作用するのでしょうか。近年の研究によると、BPA が細胞内に取り込まれると、核内受容体nuclear receptorというタンパク質に結合して、内分泌かく乱物質endocrine disruptor (いわゆる環境ホルモン) としてはたらくことが分かってきました。内分泌かく乱物質とは、いうなれば自然界における「外来種」のような存在です (図2)。

図2
図2内分泌かく乱物質のはたらき 侵略的な外来種は、えさを横取りしたり、土壌をあらしたりして生態系を乱す。これと同じように、内分泌かく乱物質は天然ホルモンかのように核内受容体へ結合することで、ホルモン作用を引き起こしたり、天然ホルモンの結合をブロックしたりする。

外から来た生物がもともとの生態系を乱してしまうように、内分泌かく乱物質が核内受容体へ結合すると、天然ホルモンと同じような作用を誘発したり、逆にホルモン作用を阻害したりして生体に悪影響を及ぼします。

BPA は核内受容体に好まれる「部分」をもつ

BPA はさまざまなヒト核内受容体を標的にします。たとえば、乳がんと密接に関係している女性ホルモン受容体estrogen receptorとは、弱く結合することが古くから知られています。もっとも強く結合する受容体は、女性ホルモン関連受容体 γ 型とよばれるもので、天然ホルモン並に結合することが知られています (図3)。異物センサーとして免疫を司る構成的アンドロスタン受容体やプレグナン X 受容体とも結合します。

図3虫眼鏡をもったきゅうりくん@右下
図3女性ホルモン関連受容体 γ 型と BPA の結合 受容体 (オレンジ色) に BPA (緑色) がすっぽりと収まっている。図は理学部広報紙「理学部便り vol. 9」より引用。

これほどに多様な結合があることを鑑みると、BPA は核内受容体グループに好まれるような特定の「部分」を持っていることが予想されます。さらに視野を広げてみると、BPA と似た「部分」をもつ化学物質 (BPA 類似物質) も核内受容体と結合しやすいのではないかと推測できます。それらは私たちの身体にどのような作用を及ぼすのでしょうか。『毒薬変じて薬となる』ということわざが示すように、BPA 類似物質をうまく選べば、身体に害のあるホルモン作用を抑制したり、益のあるホルモン作用を引き起こしたりすることもできるのではないでしょうか。

研究の概要: BPA 類似物質のスクリーニング

BPA の類似物質には 20 万種類ほどもありますが、核内受容体との反応が調べられているのはたった数種類に限られます。そこで松島准教授らは、127 種類もの BPA 派生物質とそれらに関連した化合物について、女性ホルモン受容体 α 型 (ERα) との反応を系統的に調べ上げました。すると意外なことに、ある 5 種類の化合物では女性ホルモン作用を阻害するはたらきがありました。乳がんにおけるがん細胞の増殖は、女性ホルモン作用をきっかけとして起こると考えられています。したがって、本研究における阻害剤antagonistの発見は、乳がんの新薬につながる革新的な成果であるといえます。

本稿では、これらの阻害剤を見つけるに至った 3 つの実験と、分子ドッキング法molecular docking methodによる理論的な分析をご紹介いたします。また、DV-Xα という第一原理計算によって核内受容体との結合要因を解明しようという世界初の試みについてもご紹介いたします。

阻害剤はいかにして見つかったか

競合結合試験

まずは BPA 類似物質の中から受容体 ERα と結合しやすいものを絞り込みました。放射標識したリガンドradioligand[2]による競合結合試験competitive binding assayをおこないました (図4)。

図4
図4競合結合試験の概念図 リガンド vs. BPA 類似物質の「陣取り取りゲーム」によって結合能を測る試験。受容体とリガンドを混ぜると、リガンドは受容体へと容易に結合する。そこに BPA 類似物質を加えると、リガンドと BPA 類似物質とで結合競争がおこる。一部のリガンドは押しのけられて、BPA 類似物質に取って代わられる。したがって、リガンドが埋めている受容体が少ないほど、BPA 類似物質の結合能がより高いと分かる。

すると半数以上 (70 種類) もの化合物が受容体 ERα と結合していました。そのうち 21 種類の化合物 (図5) は、ビスフェノール A と同じくらいか、それよりも高い結合能を示しました。このような結果から、『ビスフェノール A と似た「部分」を持つ化学物質は受容体 ERα と結合しやすい』という推測を裏付けることができました。

図5虫眼鏡をもったきゅうりくん@右下
図5結合能が高かった 21 種類の化合物  Masuya et al. (2019) の図を改変。

レポーター遺伝子試験で生体内での作用をみる

受容体と特に結合しやすい 21 種類の化合物 (図5) は、 遺伝子転写gene transcription[3]にも大きな影響をあたえると考えられます。そこで HeLa 細胞[4]によるレポーター遺伝子試験reporter gene assayをおこない、それらの化合物が生体内でどう作用するか調べました (図6)。

図6
図6レポータ遺伝子試験の概念図 レポーター遺伝子は、遺伝子の転写がどれくらい活発かを知らせてくれる。今回の実験では、ホタルの発光酵素 (ルシフェラーゼ) に由来したレポータ遺伝子を使っている。このレポータ遺伝子を HeLa 細胞の遺伝子 (受容体 ERα に関連したもの) へ組みこむことで、遺伝子の転写が活発になるほど強く発光するように工夫している。

21 種類の化合物それぞれを HeLa 細胞へと注ぎ入れたところ、13 種類の化合物で遺伝子の転写が活発化していました[5]。一方で、残りの 8 種類では弱い転写活性しかみられませんでした。8 種類の化合物も受容体 ERα と強く結合するのに、遺伝子の転写活性へほとんど影響しないというのは不思議に思えます。この結果はいったい何を意味しているのでしょうか?

阻害剤の発見

松島准教授らは、8 種類の化合物の中に、女性ホルモン作用の阻害剤が含まれていると考えました。その真偽を確かめるべく、天然の女性ホルモン作用がこれらの化合物で抑制されるか調べました。女性ホルモン E2 によって遺伝子転写を活性化したところに、21 種類の化合物をそれぞれ加えたところ、図7 のような活性の変化が見られました。

図7
図7化合物ごとの転写活性 女性ホルモン E2 のみを加えた場合と女性ホルモン E2 と BPA 類似物質を混ぜた場合とで、レポータ遺伝子試験をおこなった。両者の結果を比べることで、遺伝子転写の活性がどれほど抑えられたか分かる。上の図では横軸が化合物を番号付けしたものであり、縦軸が相対的な活性率を表している。阻害剤を赤丸で示している。たとえば 16 番の化合物 spirobicromane では 50 % 以下にまで活性が抑えられている。Masuya et al. (2019) の図を改変。

驚くべきことに 8 種類のうち 5 種類の化合物において、活性が大幅に抑えられていました。やはり 8 種類の化合物の中には女性ホルモン作用の阻害剤が含まれていたのです。

理論的な考察: 分子レベルでみる阻害剤のはたらき

阻害剤の分子をじっと眺めると、共通点があることに気が付きます (図8)。Spirobicromane を除くと、どの阻害剤も 3 つのベンゼン環が縦にならんだ構造 (三環系ビスフェノール構造) を一部に持っています。これは偶然でしょうか? それとも本質的なものでしょうか?

図8
図8共通点をもつ 4 つの阻害剤

分子ドッキング法で分かった三環系ビスフェノールの特異性

受容体の活性化を分子レベルで見つめることで、三環系ビスフェノール構造の本質へと迫りました。受容体 ERα は、リガンドなしでは不活性だと知られています。リガンドが結合し、ある立体構造 (活性配座) を取ってはじめて活性化します。もしリガンドの代わりに三環系ビスフェノール類が結合したとすると、活性配座が乱されるように思えます。こういった分子の重ね合わせを議論するには、分子ドッキング法によるシミュレーションが有効です。

X 線回析のデータから活性配座になる場合として「ビスフェノール AF + 受容体 ERα」の結晶構造が分かっています。この複合分子の結晶構造に、阻害剤のひとつ (ビスフェノール P) をドッキング[6]してみました (図9)。

図9
図9分子ドッキング法で得られたドッキング後の複合体 らせんで描かれているのが受容体タンパク質である。アミノ酸側鎖 H524 の表面を薄緑色で表している。C 環と H524 が重なっていることを見て取れる。図は松島准教授より提供。

A 環や B 環はビスフェノール AF とほぼ重なっており、受容体になじんでいました。しかし、C 環 (フェノール環) は受容体のアミノ酸側鎖 H524 と衝突していました。一方、不活性な場合として「ビスフェノール C + 受容体 ERα」の複合分子にもドッキングしてみると、アミノ酸側鎖と衝突することなく収まっていました。ほかの阻害剤についてもシミュレーションをおこなってみても、同じように活性配座におけるアミノ酸側鎖のみを妨害していました。つまり三環系ビスフェノール構造は受容体と結合しやすいような部分を持ちながら、活性配座だけを妨げる末端を有しており、まさに阻害剤として望ましい骨格であるといえます。

さらなる理解に向けて

理論的な分析には、まだ課題が残されています。分子ドッキング法では、受容体という巨大なタンパク質の形を結晶構造から取っており、受容体は「動かないもの」としています。実際には、受容体と BPA 類似物質とが互いに作用しながら、ダイナミックに結合するはずです。とくにハロゲンを含む BPA 類似物質では、ハロゲン結合という新たな現象が加わり、より多彩な複合体が現れると期待されます。もし理論計算によって複合体を予言することができれば、思ってもみなかった効能をもつ新薬への道が開けるかもしれません。このような動機のもと、松島准教授らは無機化学でよく使われている第一原理計算 (DV-Xα 法)に注目し、DV-Xα 法を「受容体 + BPA 類似物質」の複合体に応用するという全く新しい手法を提案しました (計算の詳細については こちらをご覧ください)。

まとめと展望

ビスフェール A (BPA) は、工業製品の原材料として汎用されています。ところが近年、BPA が内分泌かく乱物質であるという負の側面が明らかになりつつあり、「BPA やその類似物質」と「ヒト核内受容体」との結合が注目を集めています。それらの反応を実際に調べた実験はまだ数えるほどしかなく、BPA 類似物質が生体に与える影響はよく分かっていません。

そこで松島准教授らは、127 種類もの BPA 類似物質について女性ホルモン受容体 α 型 (ERα) との結合能を系統的に調べ上げました。その結果、5 種類の化合物が「女性ホルモン作用の阻害剤」であることを発見しました。乳がんにおけるがん細胞の増殖は、女性ホルモン作用をスイッチとして起こります。したがって、それを OFF にする阻害剤の発見は、乳がんの新しい治療薬につながる重要な成果です。
阻害剤には共通点があり、どれもが三環系ビスフェノール構造を有していました。この構造が好まれる理由を分子ドッキング法で分析したところ、A 環と B 環が受容体と高い親和性をもち、残りの C 環が受容体の活性配座を乱していることが分かりました。三環系ビスフェノール構造は、まさに阻害剤として望ましい骨格だといえます。
さらに将来を見据えた研究として、純粋な理論計算のみから「受容体 + BPA 類似物質」を予言する新しい手法を提案しました。無機化学でよく用いられる DV-Xα 法をタンパク質系へと応用しました。この新手法が今後どのような発展をみせるのでしょうか。その動向から目が離せません。

最後に松島准教授から読者の皆さまへ向けたメッセージをご紹介いたします。
『私達は理学部で基礎研究をしています。基礎研究は「これに役立つ」とはっきり言えるものとは限りません。しかし、それらを応用し、新しい研究開発の礎 (いしずえ) となる大切なものです。今回も、女性ホルモン受容体に結合する化学物質の構造に興味を持って調べる中で、偶然に薬の開発に役立つかもしれない三環系ビスフェノール構造を見つけました。私達が理学部で行う基礎研究は、きっと幸せな未来に繋がると信じています。』

研究こぼれ話


著者短時間のうちに、効率よく計算を進めるために、研究室の学生共用の計算機やモニタなどを自分の机の周りにかき集めました。黒色の機材が私を取り囲んでいる様子は、さながら「要塞」のようだと研究室内で言われていました。優先的にモニタなどを使わせてくれた研究室の仲間に感謝しています。

Note:

  • [1] 日本では厚生労働省によって BPA 摂取量が制限されています (詳しくはこちら) 
  • [2] リガンドとは、特定の受容体に強く結合する化学物質です。また放射標識とは、放射線を放つ原子を組み込むことを指します。こうすることで放射線量の多さからリガンドの量を見積もることができます。今回の研究では、受容体 ERα の代表的なリガンドとしてエストラジオール E2 (女性ホルモンの一種) を用いており、トリチウムによって放射標識しています。
  • [3] DNA の塩基配列をもとにしてリボ核酸 (RNA) を合成すること。遺伝子が機能するためには、まずこの過程を経る必要があります。
  • [4] ヒト由来の最初の細胞株で、生物学の実験によく用いられます。
  • [5] このような天然の女性ホルモンと似たはたらきを持つ化学物質は、作動薬とよばれます。
  • [6] 分子ドッキング法の原理は至ってシンプルですが、実際にシミュレーションするにはとても大変な計算が必要となります。まずは原子を組み合わせて「リガンド+受容体」の複合分子を作らなければなりません。今回は X 線回折の結果があるので、そこで分かった結晶構造を利用しています。次に原子から阻害剤を組み上げる必要があります。こちらは結晶構造があればそれを利用し、なければ量子力学にしたがって構造を作ります。複合分子から受容体のみを抜き出して、受容体にある個々の原子と阻害剤にある個々の原子との相互作用を定義します。ここまでがドッキングの下準備です。ドッキングの際には、阻害剤の位置や角度などを動かしながら、相互作用で稼ぐエネルギーを最も大きくするような状態を決めます。こうして得られた状態がドッキング後の状態です。阻害剤にはさまざまな自由度があることを考えると、分子ドッキング法の大変さが分かります。

より詳しく知りたい方は・・・

タイトル
Discovery of novel oestrogen receptor α agonists and antagonists by screening a revisited privileged structure moiety for nuclear receptors
著者
Takahiro Masuya, Masaki Iwamoto, Xiaohui Liu, Ayami Matsushima
掲載誌
Scientific Reports 9:9954 (2019)
研究室HP
構造機能生化学研究室
キーワード
ビスフェノール A、女性ホルモン受容体、三環系ビスフェノール構造、分子ドッキング法、DV-Xα